脳組織における体細胞変異は統合失調症の病因として重要な役割を果たす可能性があるが，細胞種特異的な解析や動物モデルを用いた検討は十分に行われていない．われわれは統合失調症患者および動物モデル試料を用いて全エクソームシーケンシング解析を行った．患者試料は，死後脳前頭葉について神経細胞核および非神経細胞核分画を行い，細胞種ごとに解析を実施した．動物モデル試料は，妊娠マウスに母体免疫活性化処理を行い，出生仔の前頭葉および尻尾サンプルを用いた解析を実施した．死後脳前頭葉の解析では，体細胞変異の数について群間で定量的な差異は認められなかったが，神経細胞特異的な体細胞変異は，患者群でより高いアレル頻度を示した．また，動物モデルでは，神経発達関連遺伝子に体細胞変異が生じていることや，処理群において大きな個体差がみられることを明らかにした．以上から，神経細胞分化初期で生じた体細胞変異が，統合失調症の病因や病態と関連する可能性や，母体免疫活性化は脳内の体細胞変異のプロファイルに影響を与えることが示唆された．
統合失調症患者死後脳における体細胞変異の探索と母体免疫活性化の影響についての検討
1）熊本大学大学院生命科学研究部分子脳科学講座
2）Department of Geriatric Psychiatry, The Affiliated Mental Health Center of Jiangnan University
3）順天堂大学大学院医学研究科精神・行動科学
2）Department of Geriatric Psychiatry, The Affiliated Mental Health Center of Jiangnan University
3）順天堂大学大学院医学研究科精神・行動科学
精神神経学雑誌
127:
617-623, 2025
https://doi.org/10.57369/pnj.25-098
受付日：2025年1月18日
受理日：2025年5月1日
https://doi.org/10.57369/pnj.25-098
受付日：2025年1月18日
受理日：2025年5月1日
＜索引用語：細胞分化, 母体免疫活性化, 統合失調症, 体細胞変異, 全エクソーム解析＞
はじめに
ゲノムワイド関連解析（genome-wide association study：GWAS）から，統合失調症は小さな効果量を有する多数の遺伝的変異が関係するポリジェニックな疾患であると考えられている33)37)．しかし，疫学研究で示されているような遺伝要因の大きな関与はGWASの研究結果だけでは説明できず10)20)22)34)，効果量の大きなレアバリアントの影響に加え，受精後に生じうるエピジェネティックな変化7)18)27)35)38)や体細胞変異が発症リスクを高めている可能性がある3)11)28-30)．
これまで統合失調症の体細胞変異研究では，Fullard, J. F. らにより，前頭葉神経細胞および非神経細胞における全エクソームシーケンシング（whole exome sequencing：WES）解析から，体細胞一塩基変異（somatic single nucleotide variant：sSNV）や変異アレル頻度（variant allele fraction：VAF）の増加が報告されている14)．一方，Kim, M. H. らは，前頭葉でのWES解析により，sSNVの個数やVAFに差は認めなかったものの，統合失調症関連遺伝子にsSNVが集積することを報告している21)．Bae, T. らは，全ゲノムシーケンシング（whole genome sequencing：WGS）解析から，診断群間でsSNVに有意差はなかったとする一方1)，Maury, E. A. らは患者神経細胞でsSNVの変異シグネチャーに変化が認められたことを報告している26)．
本研究では，死後脳前頭葉試料から神経細胞核と非神経細胞核を分離し6)19)，細胞種特異的WES解析を行って体細胞変異のプロファイルを患者群と健常者群で比較した．また，統合失調症発症のリスク要因の1つである母体免疫活性化（maternal immune activation：MIA）4)9)に着目し，妊娠マウスにポリイノシン―ポリシチジル酸〔poly（I：C）〕を投与するpoly（I：C）モデル8)13)15)16)を利用し，仔マウス脳試料でWES解析を行った．
I．研究の方法および結果
1．方 法
米国スタンレー財団より提供された統合失調症患者および健常者それぞれ10例の前頭葉試料を使用した．蛍光標識をした抗NeuN抗体により神経細胞核（NeuN+）と非神経細胞核（NeuN-）を分画し6)19)，それぞれからDNAを調整した．また，妊娠マウス（C57B/6 N）へpoly（I：C）またはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を胎生（embryonic day：E）12日からE16まで5日間連続腹腔内投与し，生後1日の仔マウス4例の前頭葉と尾部からDNAを調製した．本研究は所属機関の倫理委員会および動物実験委員会によって承認されたものである．
150 bp pair-readのWESを行い，ヒト死後脳試料では，NeuN+画分とNeuN-画分のサンプルからそれぞれ1検体あたり平均深度×250，×230に相当するデータを得た．同様にマウス試料では平均深度×150相当のデータを得た．Mutect22)を用いてsSNVを同定した（図1）．最初にNeuN+およびNeuN-サンプルで個別に単一サンプル解析を実施し，各被験者について2細胞種間で重複するsSNV候補を得た．次にペアサンプル解析により，各被験者についてNeuN+またはNeuN-特異的なsSNVを検出した．マウスでは，同一個体の前頭葉と尾部とのペアサンプル解析により，前頭葉特異的なsSNV候補を検出した．
2．統合失調症患者前頭葉におけるsSNV
NeuN+およびNeuN-の両細胞種で共通して検出されたsSNVの個数は，健常者群では1人あたり平均15.5個，統合失調症群では10.4個であり，群間で差を認めなかった（図2）．平均VAFは，健常者群NeuN+で14.07%，NeuN-で14.02%，統合失調症群ではそれぞれ14.69%と14.71%であり，診断群間で有意差を認めなかった．
それぞれの細胞種に特異的なsSNVは，健常者群NeuN+で平均11.8個，NeuN-で9.5個，統合失調症群ではそれぞれ5.5個と6.8個であり，診断群間で有意差を認めなかった．しかし，NeuN+特異的sSNVの平均VAFは健常者群で5.71%，統合失調症群で11.67%と有意差を認めた（図2）．一方，NeuN-特異的sSNVの平均VAFに有意差はなかった．
タンパク質への機能的な影響をもつ有害なsSNVとして，統合失調症群では両細胞種で検出された共通のsSNVから6個，NeuN+特異的sSNVから2個，NeuN-特異的sSNVから1個を同定した．有害な変異をもつsSNVの割合については，診断群間で有意差を認めなかった．
3．マウスモデルにおけるsSNV
sSNVは，PBS群で平均12.5個，VAFは6.22%，poly（I：C）群では平均23.5個，VAFは6.78%であった（図3）．sSNVの個数，頻度ともに有意差は認めなかったが，poly（I：C）群では，PBS群と比較し，より大きな個体間変動を認めた．また，PBS群では合計3個，poly（I：C）群では11個の有害な変異を検出した．
図1
図2
図3
II．考察
統合失調症患者前頭葉の神経細胞特異的sSNVは健常者群と比較し高いVAFを示した．神経細胞と非神経細胞で共通するsSNVや，非神経細胞特異的sSNVのVAFは健常者と同程度であったことから，神経系細胞の分化過程で生じるsSNVが統合失調症の病因と関連することが示唆された．また，マウスモデルでの解析により，発症リスクを上昇させる代表的な環境要因の1つであるMIAは，一部の胎仔脳でより多くのsSNVを誘発していることが示唆された．
先行研究と比較すると，以前報告されたsSNVのVAF増加14)や，診断群間でのsSNV総数に差がないことなど，部分的に一致が認められた1)21)．一方，sSNVの増加14)や，統合失調症関連遺伝子群へのsSNVの蓄積21)はみられなかった．これらの不一致は，研究対象サンプルの差異やシーケンシング手法などに起因する可能性がある．特にWGS解析では，統合失調症神経細胞において転写因子結合部位へのsSNV蓄積が報告されており26)，WES解析では十分に検出できないゲノム領域への影響が考えられた．
統合失調症でみられたsSNVのVAF増加については，DNA修復機構が寄与しているかもしれない31)．この仮説検証のため，本研究で用いた検体を含む死後脳遺伝子発現データ17)を再解析したところ，DNA修復関連遺伝子ERCC6とXRCC1の発現変動を認めた．神経細胞におけるDNA修復関連遺伝子群の関与について今後の研究が期待される．
単一神経細胞WGS研究から，加齢は脳のsSNVを誘発することが報告されている23)24)．老化によって引き起こされた体細胞変異の大部分は，各細胞に固有か，ごく少数の細胞にのみ存在するため39)，検出の際に大きな課題となる25)．本研究，および以前のWES・WGS解析は単一細胞解析ではなく，加齢とsSNV数の関連性は明確には報告されていない．このため，加齢で生じたsSNVについて，統合失調症との関連を検討するには，異なる解析アプローチが必要であろう．
本研究で検出された9つの有害変異は，これまでのsSNV研究で報告されているゲノム座位や遺伝子とは異なっていた．有害なsSNVが検出された遺伝子の1つであるCBY1は，βカテニンを抑制しWnt経路に影響を与えることが知られている36)．Wnt経路は軸索誘導や神経発生などを通じて統合失調症と関連していることが知られおり，先行研究でも，WNT10BにおいてsSNVが同定されている14)．このため，Wnt経路に生じたsSNVが病因と関連している可能性が考えられる．また，他に有害なsSNVが検出された遺伝子の1つであるDOHHは，翻訳開始因子に不可欠なヒプシンの翻訳後修飾を触媒する酵素をコードしている32)．DOHHの変異は，発育遅延，知的障害，小頭症などの神経発達表現型と関連していることが知られている40)．
本研究では，マウスMIAモデルを使用したが，われわれはこのモデルにおいて，別のタイプの体細胞変異であるトランスポゾン新規挿入の増加を報告している5)．poly（I：C）投与群仔マウスでは，sSNVのVAF増加は検出されなかったが，sSNVの個数に大きな変動を認めた．また，poly（I：C）投与群の11個の有害なsSNVのなかで，ある仔マウスは6個，別の仔マウスは4個のsSNVを有していた．これらの結果は，一部の仔マウスがよりMIAの影響を受け，体細胞変異の負担をもつ可能性を示唆している．poly（I：C）群で有害なsSNVが検出された遺伝子の多くは，神経発生過程や精神神経疾患において重要な役割を果たしており，MIAによって誘発されたsSNVが，統合失調症の病因と関連する可能性が示唆された．
III．今後の課題および方向性
本研究ではサンプルサイズが小さいため，今後はより大きなコホートでの検証が必要であろう．また，今回は成熟ニューロンマーカーであるNeuNを用いた分画を実施しているが，NenN+画分には，興奮性・抑制性といった神経サブタイプが含まれており，NeuN-画分にも多様なグリア細胞種が含まれている．今後の研究では，より洗練された細胞種特異的なアプローチが必要になると考えられる．動物モデルの研究は，さまざまな要因を制御して解析できるという大きな利点があるが，これまで精神疾患動物モデルでのsSNV研究はほとんどなかった．本研究ではfeasibility study的な位置付けにとどまっているが，今後大規模な体系的解析の実施が望まれる．
おわりに
Bioinformatics解析では，採用する解析法や閾値の設定で結果が大きく異なってしまいがちである．原著論文12)中で直接言及はしていないが，今回，多くのwet実験を繰り返しながら，納得できる解析パイプラインを構築した．研究の背景に多くの苦闘があったことを付記しておきたい．
本論文はPCN誌に掲載された最新の研究論文12)を編集委員会の依頼により，著者の1人が日本語で書き改め，その意義と展望などにつき加筆したものである．
なお，本論文に関連して開示すべき利益相反はない．
謝 辞 マウスWESは，JSPS KAKENHI 221S0002によってサポートされた．また，JSPS KAKENHI JP18H02753，JP18H05430，JP21K07548，JP23H02840，JP23H03838，JP22K07583，および，AMED助成金番号JP19dm0207074によってサポートされた．
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